Влияние возраста матери на экспрессию генов при развитии от GV к MII в эуплоидных яйцеклетках человека
11.01.2022
Поделиться
Цель исследования
Обнаружить (если таковые имеются) различия, связанные с возрастом матери, в экспрессии генов во время перехода от стадии зародышевого пузырька (GV) к стадии метафазы II (MII) в эуплоидных яйцеклетках человека.
Краткое резюме
Наблюдалось уменьшение связанных с митохондриями транскриптов при развитии ооцитов от стадии GV к стадии MII с ярко выраженным снижением их количества в ооцитах MII возрастных пациенток.
Актуальность
Раннее эмбриональное развитие зависит от материнских транскриптов, накопленных и сохраненных в яйцеклетке во время оогенеза. Транскрипционная активность яйцеклетки, которая определяет ее конечный потенциал развития, может зависеть от возраста женщины и объяснять снижение компетентности яйцеклеток у более старших пациенток (группа AMA) по сравнению с более молодыми (группа YMA). Экспрессия генов была изучена в ооцитах человека и животных; однако секвенирование РНК может дать дальнейшее представление о профилировании транскриптома GV и созревших in vivo эуплоидных ооцитов MII пациентов в группах YMA и AMA.
Дизайн исследования
В исследовании согласились принять участие 15 женщин, проходивших лечение от бесплодия в одном отделении ЭКО. Были пожертвованы пять яйцеклеток GV и пять MII шести женщин в возрасте 21-26 лет (когорта YMA) и пять яйцеклеток GV и шесть MII шести женщин в возрасте 41-44 лет (когорта AMA), проходящих курс ЭКО. Образцы собрали в течение четырех месяцев. РНК выделяли и глубоко секвенировали на одноклеточном уровне. Все доноры предоставили яйцеклетки GV или MII.
Материалы и методы
Денудацию донорских яйцеклеток проводили через 38 часов после инъекции ХГЧ; очищенные яйцеклетки помещали в лизирующий буфер, дополненный ингибитором РНКазы. Образцы хранились при температуре -80 °C до дальнейшего использования. Выделенная из ооцитов GV и MII РНК подвергалась библиотечной подготовке с использованием метода праймирования олигодезокситимидином (DT) (анализ РНК SMART-Seq v4 с ультранизким вводом; Takara Bio, Япония) и анализа подготовки библиотеки ДНК Nextera XT (Illumina, США) с последующим глубоким секвенированием. Обработка данных, оценка качества и анализ биоинформатики проводились с использованием исходного программного обеспечения, в основном включающего FastQC, HISAT2, Stringtie и Edger, наряду с анализом функциональных аннотаций, в то время как для определения статуса плоидности использовался пакет scploid R.
Результаты
После глубокого секвенирования отдельных ооцитов GV и MII как в когортах YMA, так и в когортах AMA было обнаружено, что несколько сотен транскриптов экспрессируются на очень разных уровнях. Когда сравнивали транскриптомы яйцеклеток YMA и AMA MII, наиболее значимые из них были связаны со структурой и функцией митохондрий, включая биологические процессы, сборку комплекса I дыхательной цепи митохондрий и прекращение трансляции митохондрий (частота ложных открытий (FDR) от 6,0E−10 до 1,2E−7). Эти результаты указывают на более высокий энергетический потенциал когорты YMA MII, который снижается с возрастом. Другие биологические процессы, которые были значительно выше в когорте YMA MII, включали транскрипты, участвующие в процессе трансляции (FDR 1.9E−2). Отсутствие этих транскриптов может привести к неправильному синтезу белка до или после оплодотворения яйцеклеток AMA MII.
Оригинал статьи
Обнаружить (если таковые имеются) различия, связанные с возрастом матери, в экспрессии генов во время перехода от стадии зародышевого пузырька (GV) к стадии метафазы II (MII) в эуплоидных яйцеклетках человека.
Краткое резюме
Наблюдалось уменьшение связанных с митохондриями транскриптов при развитии ооцитов от стадии GV к стадии MII с ярко выраженным снижением их количества в ооцитах MII возрастных пациенток.
Актуальность
Раннее эмбриональное развитие зависит от материнских транскриптов, накопленных и сохраненных в яйцеклетке во время оогенеза. Транскрипционная активность яйцеклетки, которая определяет ее конечный потенциал развития, может зависеть от возраста женщины и объяснять снижение компетентности яйцеклеток у более старших пациенток (группа AMA) по сравнению с более молодыми (группа YMA). Экспрессия генов была изучена в ооцитах человека и животных; однако секвенирование РНК может дать дальнейшее представление о профилировании транскриптома GV и созревших in vivo эуплоидных ооцитов MII пациентов в группах YMA и AMA.
Дизайн исследования
В исследовании согласились принять участие 15 женщин, проходивших лечение от бесплодия в одном отделении ЭКО. Были пожертвованы пять яйцеклеток GV и пять MII шести женщин в возрасте 21-26 лет (когорта YMA) и пять яйцеклеток GV и шесть MII шести женщин в возрасте 41-44 лет (когорта AMA), проходящих курс ЭКО. Образцы собрали в течение четырех месяцев. РНК выделяли и глубоко секвенировали на одноклеточном уровне. Все доноры предоставили яйцеклетки GV или MII.
Материалы и методы
Денудацию донорских яйцеклеток проводили через 38 часов после инъекции ХГЧ; очищенные яйцеклетки помещали в лизирующий буфер, дополненный ингибитором РНКазы. Образцы хранились при температуре -80 °C до дальнейшего использования. Выделенная из ооцитов GV и MII РНК подвергалась библиотечной подготовке с использованием метода праймирования олигодезокситимидином (DT) (анализ РНК SMART-Seq v4 с ультранизким вводом; Takara Bio, Япония) и анализа подготовки библиотеки ДНК Nextera XT (Illumina, США) с последующим глубоким секвенированием. Обработка данных, оценка качества и анализ биоинформатики проводились с использованием исходного программного обеспечения, в основном включающего FastQC, HISAT2, Stringtie и Edger, наряду с анализом функциональных аннотаций, в то время как для определения статуса плоидности использовался пакет scploid R.
Результаты
После глубокого секвенирования отдельных ооцитов GV и MII как в когортах YMA, так и в когортах AMA было обнаружено, что несколько сотен транскриптов экспрессируются на очень разных уровнях. Когда сравнивали транскриптомы яйцеклеток YMA и AMA MII, наиболее значимые из них были связаны со структурой и функцией митохондрий, включая биологические процессы, сборку комплекса I дыхательной цепи митохондрий и прекращение трансляции митохондрий (частота ложных открытий (FDR) от 6,0E−10 до 1,2E−7). Эти результаты указывают на более высокий энергетический потенциал когорты YMA MII, который снижается с возрастом. Другие биологические процессы, которые были значительно выше в когорте YMA MII, включали транскрипты, участвующие в процессе трансляции (FDR 1.9E−2). Отсутствие этих транскриптов может привести к неправильному синтезу белка до или после оплодотворения яйцеклеток AMA MII.
Оригинал статьи